Cloramfenicolo 141

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Caratterizzazione di cloramfenicolo e Resistenza Florfenicolo in Escherichia coli associati bovina diarrea RIASSUNTO Florfenicolo, un analogo fluorurato veterinario del Tiamfenicolo, è approvato per il trattamento dei patogeni respiratori bovini negli Stati Uniti. Tuttavia, la resistenza florfenicolo è emersa di recente tra i veterinari Escherichia coli isolati incriminato nella diarrea bovina. Il gene Flo, che conferisce resistenza a florfenicolo e cloramfenicolo, è stato precedentemente identificato nel Photobacterium piscicida e Salmonella enterica sierotipo Typhimurium DT104. Il prodotto del gene Flo è strettamente legato alla proteina CmlA identificato in Pseudomonas aeruginosa. Il gene cmlA conferisce resistenza al cloramfenicolo non enzimatica tramite un meccanismo di efflusso. Quarantotto E. coli isolati recuperato da vitelli con diarrea, tra cui 41 che erano entrambi cloramfenicolo e florfenicolo resistenti, sono stati analizzati per la presenza di entrambi i geni Flo e cmlA. Quaranta-due dei 44 isolati per il quale MIC florfenicolo erano 16 g / ml sono risultati positivi tramite PCR per il gene flo. Tutti E. coli isolati per i quali MIC florfenicolo erano 8 g / ml sono risultati negativi per il gene flo (n = 4). Dodici di E. coli isolati sono stati positivi per cmlA. e microfoni cloramfenicolo per tutti i 12 stati 32 g / ml. Inoltre, otto isolati sono stati positivi sia per Flo e cmlA. ed entrambe le MIC Florfenicolo e cloramfenicolo per questi isolati erano 64 g / ml. analisi della sequenza di DNA del gene E. coli flo dimostrato 98 identità alle sequenze GenBank pubblicati sia Typhimurium sierotipo flo St e P. piscicida pp-flo. Il gene è stato identificato flo su plasmidi alto peso molecolare di circa 225 kb tra la maggioranza di Florfenicolo resistente E. coli isolati. Tuttavia, non tutto il florfenicolo resistente E. coli isolati testati contenevano le grandi flo plasmidi - positive. Questo suggerisce che molti dei coli isolati può possedere un gene cromosomico flo. Il E. coli flo genica specifica non enzimatica cross-resistenza sia florfenicolo e cloramfenicolo, e la sua presenza tra bovino E. coli isolati di diversa estrazione genetici indica una distribuzione molto più ampia di quanto si pensasse. Attualmente, vi è un aumento di interesse pubblico e scientifico nell'uso di antimicrobici terapeutici e sub-terapeutiche negli animali. Ciò è dovuto principalmente alla possibile comparsa e la diffusione di batteri patogeni zoonotici multiple-resistenti ai farmaci (1. 8. 9. 22. 27. 32). Antimicrobici farmaco-resistenti batteri patogeni negli animali rappresentano un rischio non solo per la salute degli animali, ma forse per l'uomo tramite la trasmissione da agenti patogeni di origine alimentare (8. 9. 22. 27. 32). Le infezioni causate da batteri antibiotico-resistenti sono un problema di salute animale grave e costosa. Queste infezioni prolungare la malattia e, se non curata in tempo, con più costose, agenti antimicrobici alternativi, può portare ad un aumento della morbilità e della mortalità. Una delle malattie più impegnativi di fronte veterinari e produttori di bestiame oggi è colibacillosi, una grave forma di diarrea, che causa notevole perdita finanziaria per vacca e vitello produttori (10. 37). Ci sono diversi agenti eziologici infettivi che possono causare colibacillosi nei bovini tuttavia, Escherichia coli è riconosciuta come la più importante causa batterica singolo (31. 36. 37). Numerosi sierotipi di E. coli sono stati incriminati, ma la maggior parte sono enterotossigene E. coli (ETEC) ceppi. Questi ceppi di solito possiedono l'adesione K99 (F5) e producono termostabile (STA o STB) e / o termolabile (LT) enterotossine (36. 37). L'aspetto più importante del trattamento di E. coli colibacillosi - related è quello di correggere la perdita di elettroliti che accompagna, la disidratazione e acidosi. Tuttavia, la terapia antimicrobica è spesso avviati allo stesso tempo, nel tentativo di eliminare il patogeno E. coli. Florfenicolo d - threo-3-fluoro-2-dichloroacetamido-1- (4-metilsolfonilfenil) -1-propanolo è un analogo strutturale fluorurato di Tiamfenicolo e cloramfenicolo approvato dalla Food and Drug Administration (FDA) nel 1996 per il trattamento delle vie respiratorie dei bovini agenti patogeni come Pasteurella spp. Tuttavia, non è attualmente approvato per il trattamento di E. coli - related bovini malattie enteriche negli Stati Uniti. Inoltre, non ci sono NCCLS approvato i punti di interruzione per E. coli attualmente disponibili tuttavia, il punto di interruzione di resistenza per patogeni respiratori bovine (cioè Pasteurella multocida) è di 8 g / ml (25). Florfenicolo non è approvato per uso umano tuttavia, è correlato al cloramfenicolo e può selezionare per la resistenza incrociata tra i batteri patogeni. Florfenicolo ha dimostrato di avere uno spettro di attività simile a quella di cloramfenicolo, tranne che è attiva a concentrazioni inferiori rispetto cloramfenicolo contro una varietà di batteri isolati clinici, inclusi batteri cloramfenicolo resistenti (16. 26. 33). Florfenicols meccanismo di azione è diretto a interrompere la sintesi proteica batterica legandosi alla subunità 50S del ribosoma batterico ed è generalmente considerata batteriostatica (12. 23. 26. 33). Né acetiltransferasi cloramfenicolo (CAT), l'enzima responsabile della maggior parte della resistenza plasmide-mediata al cloramfenicolo (12), né il noto gene di resistenza cloramfenicolo non enzimatica (cmlA) conferisce resistenza Florfenicolo (14, 18. 23). Fino a poco tempo fa, erano conosciuti non geni che conferiscono resistenza ai derivati ​​fluorurati di cloramfenicolo o tiamfenicolo. Tuttavia, nel 1996 i ricercatori in Giappone identificato un nuovo gene plasmidica (pp-Flo) da Photobacterium piscicida che codificato resistenza sia cloramfenicolo e florfenicolo (19). Più recentemente, Bolton et al. descritto un gene con 97 omologia con il gene pp-flo tra Salmonella enterica sierotipo Typhimurium DT104 isolati, che loro chiamarono flo (9) St. Isolati di Salmonella in possesso flo St gene anche esposto a doppia resistenza al cloramfenicolo e florfenicolo (4. 9). Il gene Flo è stato inoltre individuato di recente tra cloramfenicolo resistenti Salmonella enterica sierotipo Agona isolati recuperati dal pollame in Belgio e florfenicolo resistente E. coli dal pollame negli Stati Uniti (13 18). Il presente studio coinvolge 48 ceppi resistenti agli antimicrobici di E. coli isolati da vitelli diarroiche e presentato al Veterinary Diagnostic Laboratory North Dakota (ND-VDL) dal 1997 al 1998. Dal c'era informazioni limitate per quanto riguarda la resistenza florfenicolo in letteratura e praticamente nessuno concernente E. coli. uno studio è stato avviato per determinare il meccanismo della resistenza nei bovini E. coli isolati. MATERIALI E METODI isolati batterici. Il presente studio si concentra su 48 ceppi di E. coli recuperati dai casi vitello diarrea presentate alla ND-VDL dal 1997 al 1998. Tutti i vitelli erano meno di 2 settimane di vita, e molte delle case history hanno indicato che florfenicolo è stato utilizzato in un extra maniera label nel tentativo di curare la diarrea. Batteri E. coli sono stati isolati da campioni fecali necroscopia o da vitelli che soffrono di diarrea. I campioni sono stati piastrati su piastre di agar sangue e MacConkey. test indolo e ossidasi sono stati eseguiti su colonie lattosio-positive. API strisce reattive 20E (bioMrieux Vitek, Hazelwood, Mo.) sono stati utilizzati anche per confermare l'identificazione di E. coli. Bovine E. coli isolati Visualizzazione ridotta suscettibilità a florfenicolo sono stati successivamente raccolti per ulteriori analisi per determinare il meccanismo di resistenza. Gli isolati sono stati memorizzati come 10 titoli glicerolo a 80 ° C fino al momento dell'analisi. determinazione sensibilità agli antibiotici. MIC antimicrobici per E. coli isolati sono stati determinati utilizzando il sistema di sensibilità agli antibiotici Sensititre automatizzato (Trek Diagnostic Systems, Westlake, Ohio) e interpretato secondo le linee guida NCCLS per i metodi microdiluizione in brodo (24. 25). test di sensibilità Sensititre è stata eseguita secondo le istruzioni del produttore. I seguenti antimicrobici sono stati analizzati: amikacina, acido amoxicillina-clavulanico, ampicillina, AMP, ceftiofur, ceftriaxone, cefalotina, cloramfenicolo, ciprofloxacina, florfenicolo, gentamicina, kanamicina, acido nalidixico, streptomicina, sulfametossazolo, tetraciclina, e trimetoprim-sulfametossazolo. E. coli ATCC 25922, E. coli ATCC 35218, e Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 sono stati usati come controlli nelle determinazioni MIC. PCR, isolamento e sequenziamento del coli flo E. e geni cmlA. Oligonucleotidi sono stati sintetizzati da Biosintesi (Lewisville, Tex.). La sonda flo PCR derivato è stata ottenuta usando primers precedentemente pubblicati (9) e ha prodotto un amplicone 215-bp all'interno della regione codificante. Due primer PCR supplementari sono stati creati che fiancheggiano l'intero gene pp-flo. E. coli Flo-F corrisponde alla nucleotidi 981 a 1004 (TTGTTGTTGCGGCGCTCTGTAAGG), ed E. coli Flo-R corrisponde ai nucleotidi 2405 a 2384 (CGGCGACGGCGATGAACTGAAC) della sequenza pubblicata (GenBank adesione n. D37826), ottenendo un amplicone previsto di 1.424 bp. La sonda cmlA PCR-derivato è stato amplificato utilizzando primer precedentemente pubblicati (18) e ha prodotto un amplicone 698 bp. PCR sono state effettuate in un termociclatore 2400 (Perkin-Elmer Applied Biosystems, Norwalk, Conn.). Duecento microlitri di ciascun prodotto di PCR è stato separato da 1,5 agarosio gel a 75 V per 2 h. Le bande appropriati sono stati asportati e purificate utilizzando GenElute colonne Spin (Supelco, Bellefonte, Pa.). Gli ampliconi della PCR purificati sono stati sequenziati presso l'Università del Minnesota avanzata Genetic Analysis Center, St. Paul, Minnesota. Sequenza comparazioni sono state effettuate utilizzando il programma NCBI-BLAST (2). PFGE. Cinque-millilitro brodo culture di ogni isolato sono state coltivate durante la notte a 37 ° C. Il pellet cellulare è stato raccolto, incorporato in spine agarosio, e lisate come precedentemente descritto (5. 30). spine agarosio sono stati digeriti con 10 U di Xba I (Promega, Madison, Wis.) durante la notte a 37 ° C. Digested DNA è stato separato su un gel di agarosio 1.2 usando il sistema CHEF-DRII campo pulsato gel elettroforesi (PFGE) (Bio-Rad, Hercules, Calif.). L'elettroforesi è stata effettuata per 25 ore a 6 V con un tempo di impulso rampa da 2 a 40 s in 0.5 Tris-borato-EDTA (TBE) tampone (14C). standard di peso molecolare sono stati Saccharomyces cerevisiae YPH 755 cromosomi (Roche Biochemicals, Indianapolis, Ind.). documentazione gel e l'analisi filogenetica del E. coli isolati sono stati effettuati utilizzando il RFLPScan e programmi TREECON come precedentemente descritto (21). Mappatura del gene flo nei bovini E. coli isolati. Il gene flo stata inizialmente identificata in un plasmide trasferibili R nel patogeno pesci P. piscicida (18). Un omologo flo è stato recentemente mappato all'interno di un locus multidrug resistance che è affiancato da due classe 1 integroni in sierotipo Typhimurium DT104 e sierotipo Agona (3. 11. 13). primer PCR sono stati sviluppati per determinare se il gene E. coli Flo aveva una organizzazione genetica simile a quello osservato in entrambi i sierotipo Typhimurium DT104 o P. piscidida. I primi primer PCR sono stati progettati per amplificare una porzione di Flo e geni mappatura a valle (tetR) all'interno della Salmonella multidrug resistance (MDR) locus (GenBank adesione n. AF071555). La seconda serie PCR è stato mirato a Flo e l'ampia gamma-host-plasmide RSF1010 Replicon identificato in P. piscicida (GenBank adesione n. D37826). Primer flo map2F (GGGATCGGCGAAACTTTAC) e Flo map2R ricottura (TGTGGTCGGTTCCGTTCTC) in posizioni nucleotide 5330 di Flo e 6073 del tetR all'interno del sierotipo Typhimurium DT104 (GenBank adesione n. AF07155), risultando in un amplicone 744 bp. Primer flo map2F (GGGATCGGCGAAACTTTAC) e PP - flo MAPR ricottura (TCCGCGTCCTTGCAATAC) a nucleotide posizioni 1953 e 2723 del P. piscicida plasmide-mediata sequenza di Flo (GenBank no. D37826 adesione), con un conseguente amplicone 771 bp. Le condizioni di PCR sono stati utilizzati precedentemente descritto (17). Rilevazione di plasmidi ad alto peso molecolare per il trattamento S1 nucleasi e PFGE. A causa della loro struttura, grandi plasmidi circolari non vengono risolti mediante PFGE. Questo problema può essere superato utilizzando S1 nucleasi digestione prima PFGE. S1 nucleasi crea discontinuità tra i plasmidi, che permettono loro di entrare nel gel durante PFGE. spine agarosio preparato per PFGE sono stati trattati con nucleasi S1 (Roche Biochemicals) come precedentemente descritto (6. 22). I plasmidi sono stati separati su un gel di agarosio 1,5 utilizzando il sistema CHEF-DRII PFGE (Bio-Rad). I plasmidi sono stati sottoposti ad elettroforesi inizialmente per 14 ore a 6 V con un tempo di impulso di 45 s, seguito da un programma di 6 ore a 6 V con un tempo di impulso di 25 s. standard di peso molecolare sono stati S. cerevisiae YPH 755 cromosomi (Roche Biochemicals). analisi ibridazione Southern. Megabase DNA è stato cancellato alle membrane di nylon utilizzando la procedura di Bio-Rad. In breve, il DNA in gel etidio bromuro-macchiato è stato scalfito usando un transilluminatore UV (Fisher Scientific) a 60 MJ di energia. I gel sono stati immersi in 0,4 N NaOH1.5 M NaCl per 15 minuti, e poi il DNA è stato trasferito per 4 ore a Magnagraph nylon (MSI, Westborough, Mass.) Utilizzando il modello 785 Vacuum Blotter (Bio-Rad) con NaOH come il buffer . Dopo il trasferimento, membrane di nylon sono stati lavati brevemente in 0.5 M Tris, pH 7,6, seguito da 2 SSC (1 SSC è 0,15 M NaCl più 0,015 citrato di sodio M) (29). Le membrane sono state bloccate e sondate con una porzione PCR-amplificato della sonda gene di resistenza Florfenicolo come precedentemente descritto (18). Nucleotide numero di sequenza di adesione. La sequenza del gene bovino E. coli flo è stato assegnato GenBank adesione n. AF252855. RISULTATI E DISCUSSIONE pattern di resistenza antimicrobica nei bovini E. coli. Quarantotto E. coli isolati recuperato da vitelli con diarrea sono stati testati per la loro resistenza agli agenti antimicrobici di significato umano e veterinario in base al NCCLS metodi microdiluizione in brodo e linee guida (Tabella 1). È interessante notare che il 90 di bovini E. coli isolati erano resistenti al cloramfenicolo (Tabella 1), un antibiotico che è stato vietato di uso veterinario negli animali alimentari negli Stati Uniti dal 1980 (15). Novantadue per cento di E. coli isolati erano anche resistenti a florfenicolo sulla base del punto di interruzione NCCLS per gli agenti patogeni bovini respiratorie, 8 g / ml (25). Oltre al cloramfenicolo e Florfenicolo resistenza, tutti gli isolati bovini erano resistenti ad almeno quattro antimicrobici e 37 (77) isolati erano resistenti ad almeno nove antimicrobici. Il modello di resistenza agli antibiotici più comuni osservati nel bovina E. coli isolati inclusa la resistenza al cloramfenicolo, florfenicolo, amoxicillina, l'ampicillina, ceftiofur, cefalotina, gentamicina, kanamicina, streptomicina, sulfametossazolo, tetraciclina, e trimetoprim-sulfametossazolo (n 14). fenotipi di resistenza antimicrobica di bovini E. coli isolati Con più fenotipi di resistenza agli antibiotici in modo comune tra i bovina E. coli isola, la domanda diventa allora, qual è la pressione selettiva di guida che mantiene la resistenza cloramfenicolo in assenza del suo utilizzo Una possibilità è la uso di florfenicolo, un derivato fluorurato di cloramfenicolo che è stato approvato per il trattamento della malattia respiratoria bovina nel 1996. batterica resistenza crociata al cloramfenicolo e florfenicolo viene sempre riportato ed è stata attribuita ad un omologo del gene di efflusso resistenza al cloramfenicolo, cmlA (4 . 9. 13, 18) e non i geni CAT tradizionali (7. 12. 14. 26. 33, 34. 35). Questo analogico cmlA, chiamato flo. è stato descritto nel patogeno pesce P. piscicida. isolati in Giappone, dove florfenicolo è abitualmente utilizzato in acquacoltura (19). Questo gene è stato poi trovato in altri batteri, tra cui sierotipo Typhimurium DT104 (4. 9), sierotipo Agona (13), e aviaria E. coli (18). Abbiamo studiato la possibilità che l'emergente fenotipo di resistenza cloramfenicolo osservati nei bovini E. coli isolati in realtà è dovuta alla diffusione di questo gene di resistenza florfenicolo. Identificazione del gene di resistenza flo in bovini E. coli. primer PCR basati sulla sequenza nucleotidica pp-flo pubblicato, amplificati 1,4-kb prodotto di PCR da chloramphenicol - e Florfenicolo resistente bovini E. coli isolati. analisi della sequenza di DNA del gene E. coli flo dimostrato 98 identità alle sequenze GenBank pubblicati sia Typhimurium sierotipo flo St e P. piscicida pp-flo (AF118107 e D37826., rispettivamente). DNA analisi di sequenza usando il programma NCBI-BLAST (2) prevede una cornice di lettura aperta (ORF) di 1.215 bp, dimostrando la massima identità (98) con il gene pp-flo da P. piscicida (19), il cmlA - come gene descritto nel locus DT104 MDR (11), e il flo St gene descritto da Bolton et al. (9). Questo 1.215-bp ORF traduce in un ipotetico proteina di 404 aminoacidi. Usando BLAST-p (2), è stato determinato che questa proteina ipotetica dimostrato 98 e 89 sequenza aminoacidica omologia con precedentemente descritto flo St e prodotti genici pp-flo rispettivamente. C'era anche 49 identità tra il E. coli ipotetica proteina Flo e la resistenza al cloramfenicolo gene prodotto enzimatico precedentemente descritto CmlA. La prova che il gene di resistenza Flo è ampiamente diffuso tra bovino E. coli isolati. Forty-one (85) del E. coli isolati saggiati erano resistenti sia cloramfenicolo (MIC, 32 g / ml) e florfenicolo (MIC, 16 g / ml). Per 36 di questi isolati di E. coli, MIC florfenicolo erano 128 g / ml, superiori a quelli precedentemente riportati per florfenicolo resistente E. coli (9), ma paragonabile a MIC osservati per sierotipo Typhimurium DT104 (18). Questi isolati sono stati ulteriormente analizzati per la presenza di entrambi flo e geni efflusso cmlA. Quaranta-due dei 44 isolati che mostravano diminuita suscettibilità a florfenicolo (MIC, 16 g / ml) sono risultati positivi mediante PCR per il gene flo (Tabella 2). Tutti E. coli isolati per i quali MIC florfenicolo erano 8 g / ml sono risultati negativi per il gene flo (n = 4). La prevalenza di Flo e geni cmlA in cloramfenicolo resistenti bovina E. coli Dodici E. coli isolati sono stati positivi mediante PCR per il gene cmlA. Inoltre, otto isolati sono stati positivi sia per Flo e geni cmlA, ed entrambe le MIC Florfenicolo e cloramfenicolo per questi isolati sono stati elevati (64 g / ml) (Tabella 2). Quattro isolati sono risultati negativi per flo ma positiva per cmlA. È interessante notare che, per due di questi quattro isolati, MIC florfenicolo sono stati elevati (16 g / ml). Il gene putativo cloramfenicolo efflusso cmlA è stato precedentemente dimostrato di non conferire resistenza a florfenicolo ed è stato ulteriormente individuato su un elemento trasponibile in P. aeruginosa (7. 14, 18). Tuttavia, vi sono poche informazioni riguardanti la presenza di cmlA in E. coli e conseguente fenotipi di resistenza. È possibile che i geni cmlA nei due bovina Florfenicolo resistente E. coli isolati che la mancanza flo mutazioni accumulate conseguente Florfenicolo riconosciuta come substrato efflusso. Ulteriori ricerche su questi due ceppi è certamente giustificata. Per determinare se bovina florfenicolo resistente E. coli isolati rappresentato diffusione di un ceppo clonale, 45 dei 48 isolati sono stati analizzati mediante PFGE. Utilizzando il metodo vicino di casa-giunzione e tifo l'albero contro il ceppo di E. coli LE392 (K-12), sono stati osservati 44 diversi rami (Fig.1). Solo due isolati, CVM1814 e CVM1816, visualizzate lo stesso modello PFGE. Questa estrema diversità genetica suggerisce che la resistenza Florfenicolo non è limitata ad un particolare sfondo cromosomica ed è probabilmente dovuto alla diffusione del gene flo via trasposoni mobili e / o un plasmide (s). albero filogenetico di bovini florfenicolo resistente E. coli. Il DNA totale è stato digerito con Xba I e separati da PFGE. marcatori di peso molecolare sono stati S. cerevisiae ceppo YPH 755 cromosomi. Somiglianze tra E. coli profili di PFGE sono stati identificati attraverso l'analisi cluster utilizzando il metodo vicino di casa-giunzione per disegnare un albero filogenetico (21). L'analisi filogenetica ha identificato 44 profili di PFGE nel bovina 45 florfenicolo resistente E. coli isolati analizzati. Le mappe gene di resistenza a flo plasmidi ad alto peso molecolare nei bovini E. coli. Recentemente, Briggs e Fratamico caratterizzano il luogo MDR del sierotipo penta-resistenti agli antibiotici Typhimurium DT104 (11). Questo luogo contiene il gene di resistenza flo florfenicolo. che è affiancato da un lato da un integroni classe 1 contenente streptomicina / spectinomicina aadA2 gene di resistenza e dall'altro dal gene di resistenza alla tetraciclina, TETA (3. 11. 13). Per determinare se flo - positivo bovina E. coli isolati hanno una organizzazione genetica simile, primer PCR mirati per Flo e geni a valle nel locus MDR di sierotipo Typhimurium DT104 sono stati progettati (Fig. 2). analisi PCR di un sierotipo Typhimurium DT104 isolare ha provocato un prodotto di PCR di circa 750 bp, corrispondente in termini di dimensioni alla amplicone previsto tra Flo e tetR (Fig. 2). Non ampliconi della PCR sono stati osservati per primer ancorate in sequenze di DNA a valle del locus DT104 MDR e Flo nel bovina florfenicolo resistente E. coli isolati. Tuttavia, diversi bovina florfenicolo resistente E. coli isolati ceduto ampliconi 770-bp utilizzando primer PCR all'interno di Flo e valle all'interno del plasmide RSF1010 replicone P. piscicida R (Fig. 2). Questo suggerisce trasferimento orizzontale del gene flo E. coli attraverso l'acquisizione di grandi plasmidi larga-host-range. Confronto tra la posizione del gene Pia in sierotipo Typhimurium DT104, P. piscicida. ed E. coli. primer PCR sono stati progettati per amplificare una porzione di Flo e geni mappatura a valle (tetR) all'interno del locus Salmonella MDR o per amplificare Flo e la replicone RSF1010 identificato in P. piscicida. Primer flo map2F e PP - flo MAPR ricottura a nucleotide posizioni 1953 e 2723 del plasmide-mediata sequenza flo P. piscicida, risultando in un amplicone 771 bp. Primer flo map2F e Flo map2R ricottura a posizioni nucleotidiche 5330 di Flo e 6073 del tetR all'interno del sierotipo Typhimurium DT104 MDR locus, con un conseguente amplicone 744 bp. Poiché mappatura PCR indicato collegamento tra flo e la sequenza RSF1010 replicone, abbiamo preceduti per confermare la posizione di flo su un plasmide (s) in bovini E. coli. Il gene è stato identificato flo su plasmidi ad alto peso molecolare di S1 ​​nucleasi digestione e PFGE. Il gene di resistenza flo mappato bovina E. coli plasmidi di circa 225 kb. Questi plasmidi erano più grandi di quanto precedentemente descritto flo - contenenti plasmidi a aviaria E. coli (18). La presenza di tali grandi plasmidi non ha precedenti in E. coli. Mitsuda et al. precedentemente riportato la presenza di un plasmide di 170 kb in un isolato ETEC (22). Inoltre, il rapporto originale della resistenza florfenicolo tra ceppi P. piscicida attribuito ad un alto peso molecolare plasmide R trasferibili (19). Non tutto il flo - positivo bovina isolati di E. coli conteneva grandi flo plasmidi - positive, indicando che alcuni dei geni si trovano cromosomicamente. Come sierotipo Typhimurium DT104 e sierotipo Agona, il gene Pia in questi bovina E. coli isolati sembra essere situati cromosomicamente. Tuttavia, i geni flo mappati a una varietà di differenti frammenti Xba I DNA in bovini E. coli (Fig.3). Questo è in contrasto con il comune 10-kb frammento Xba I DNA contenente flo in sierotipo Typhimurium DT104 (11), e può essere causa di integrazione cromosomica flo contenente elementi mobili DNA. Location del gene di resistenza flo nei bovini genoma di E. coli da PFGE e analisi Southern. Totale E. coli DNA genomico, plasmide e cromosoma, è stato tagliato con Xba I, separati da PFGE, e sondato con flo etichettati. Corsie 2 a 15, bovini E. coli isolati. Avian E. coli ceppo 5790 è servita come controllo positivo per Flo (corsia 1). È la diffusione capillare della resistenza florfenicolo nei bovini E. coli a causa di un plasmide - contenenti comune flo Un comune 225 kb-flo - contenenti plasmide è stato identificato in diversi bovino geneticamente distinti isolati di E. coli. analisi Southern è stata utilizzata per determinare se il gene di resistenza florfenicolo, flo. mappato a un comune frammento di Xba I DNA. Ciò indicherebbe che la resistenza florfenicolo emerso nel bovina E. coli a causa di diffusione di un plasmide di resistenza comune contenente flo. Al contrario, abbiamo scoperto che Flo associata a una gamma diversificata di frammenti di DNA in Xba I bovina E. coli. con dimensioni che variano da 72 a 529 kb (Fig. 3. corsie 2 a 15). Il gene flo mappato a 14 distinti frammenti Xba I DNA in 32 bovina E. coli isolati che erano positivi per Flo. Un comune di 124 kb Xba I frammento di DNA contenente flo è stato identificato tra i nove bovino geneticamente distinti isolati di E. coli. Tuttavia, il 124-kb Xba I frammento non è situato su un plasmide comune a tale isolati. La sonda flo anche ibridato a due frammenti Xba I quattro di E. coli isolati, indicando che più copie erano presenti (Fig.3. Corsie da 2 a 5). Questi dati suggeriscono che la diffusione della resistenza florfenicolo non è attribuita ad un plasmide comune. In conclusione, il E. coli flo genica specifica non enzimatica cross-resistenza sia florfenicolo e cloramfenicolo, e la sua presenza tra bovino E. coli isolati di diversa estrazione genetici indica una distribuzione molto più ampia di quanto si pensasse. Florfenicolo e cloramfenicolo resistenza non è stata associata ad un particolare E. coli cromosomico genotipo ed è molto probabilmente dovuto alla diffusione del gene flo tramite plasmidi ad alto peso molecolare e / o un trasposone cellulare (s). I bovini E. coli florfenicolo gene di resistenza Flo non sembra essere parte del sierotipo Typhimurium DT104 MDR locus. Tuttavia, fiancheggiante DNA circonda l'coli E. flo gene è simile al R plasmide RSF1010 sequenza dal P. piscicida. Ciò suggerisce la possibilità che Florfenicolo resistenza in E. coli nasce dalla cessione intraspecie di plasmidi larga-host-range, che è stata osservata per altri fenotipi resistenza antimicrobica (20. 28). Si segnala inoltre la prima occorrenza del gene cmlA tra patogeno E. coli isolati e la possibilità che ci sono meccanismi ancora-a-essere-caratterizzati di resistenza a florfenicolo. L'emergere e la diffusione della resistenza florfenicolo tra potenzialmente patogeni bovina E. coli isolati limiterà l'uso di questo antimicrobici come alternativa extra-label per il trattamento di vitello diarrea. La ricerca è attualmente in corso di caratterizzare ulteriormente il meccanismo di efflusso putativo attribuito all'espressione del Flo e geni cmlA in florfenicol - e cloramfenicolo resistenti isolati di E. coli. RINGRAZIAMENTI Questo lavoro è stato sostenuto dal Public Health Service concessione supplemento AI22383 dal National Institutes of Health. NOTE ricevuto 14 giugno 2000. tornati per Modifica 20 agosto 2000. Accepted 13 settembre 2000. autore corrispondente. Indirizzo postale: Ufficio di Ricerca, Centro di Medicina Veterinaria, Stati Uniti Food and Drug Administration, Laurel, MD 20708. Telefono: (301) 827-8037. Fax: (301) 827-8127. E-mail: cvm. fda. gov dwhite. RIFERIMENTI Adesiyun A. A. Kaminjolo J. S. (1992) di suscettibilità agli antibiotici di Escherichia coli ceppi isolati da bestiame diarroica e non diarroica a Trinidad. Rev. Elev. Med. Veterinario. Pays Trop. 45. 260 262.Altschul S. F. Madden T. L. Schffer A. A. Zhang J. Zhang Z. Miller W. Lipman D. J. (1997) gapped BLAST e PSI-BLAST: una nuova generazione di programmi di ricerca di database di proteine. Nucleic Acids Res. 25. 3389 3402.Arcangioli M. A. Leroy-Strin S. Martel J. L. Chaslus-Dancla E. 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